Veröffentlicht
18th August 2022

Für das Erzielen von hochwertigen Ergebnissen ist eine erstklassige LC-MS nicht alles (aber sie leistet ihren Beitrag)

Die hochsensitive und selektive Analyse, die die Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) zu bieten hat, macht sie zu einem unverzichtbaren, festen Bestandteil der modernen pharmazeutischen Forschung. In der pharmazeutischen Analyse ist Genauigkeit und Folgerichtigkeit, wenn es um Ergebnisse geht, essenziell für die Gewährleistung der Warenqualität und dadurch, dass Geräte immer empfindlicher werden, muss jedes in und für die Analyse benutzte Material das bestmögliche Ergebnis garantieren können. Jeder Bestandteil der Analyse kann durch Matrixeffekte und Ionensuppression einen potenziellen Einfluss auf die Qualität der Ergebnisse haben – egal ob es sich dabei um das Lösungsmittel, die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-(HPLC)-Säule oder das zum massenselektiven Detektor weitergeleitete Gas handelt (1).

Der Matrixeffekt kann definiert werden als das Zusammenwirken aller Komponenten einer Probe mit Ausnahme der zu prüfenden Analyten (2). Ob die Hintergrundmatrix einen größeren oder kleineren Einfluss auf die Fähigkeit eines Analyts hat, zuverlässig und wiederholt die gesuchten Stoffe zu erfassen, hängt von der für die Vorbereitung der Probe verwendeten Methode ab (3). Die Unterdrückung von Ionen ist eine Form des Matrixeffekts, deren Ursprung nicht immer leicht zu bestimmen ist. Obwohl die Mechanismen hinter der Ionensuppression meist unbekannt sind, sind Unreinheiten im Gas, das dem MS zugeführt wird, ein Faktor, der zu einer Verminderung des Signal-Rausch-Verhältnis beitragen kann. Das wiederum bedeutet, dass ein LC-MS-System keine wiederholten Ergebnisse liefern kann oder erste Tests zur Überprüfung der Systemleistung nicht besteht. Der Vergleich von einer Mehrfachreaktionsüberwachung (MRM) mit einer Standardverbindung, wie dem häufig verwendeten Reserpin, liefert S/N-Daten, die zeigen, ob die Sensitivität des Systems im Rahmen der erwarteten Anforderungen liegt.

Durch den Vergleich des Analytsignals in der Matrix mit einem Standardsignal in reinem Lösungsmittel ist es möglich festzustellen, ob es Beeinträchtigungen gibt, die eine Unterdrückung der Ionen auslösen könnten. Wie bereits erwähnt, könnte diese Methode Ionensuppressionen erfassen, aber es dem Analysten nicht unbedingt ermöglichen, den genauen Ursprung der Störstelle zu ermitteln, die die Leistungsfähigkeit beeinflusst.

PEAK Scientific Genius XE nitrogen gas generator

Der Genius XE 35 Stickstoff-Gasgenerator

In vielen Fällen können gasversorgende Geräte eine Quelle für Störgeräusche sein. Pharmazeutische Labore neigen entweder dazu Stickstoffgas in großen Mengen aus mehreren Zylindern zu beziehen, aus Dewargefäßen in flüssiger Form oder aber von Stickstoffgeneratoren. Stickstoffgeneratoren, wie PEAKs Genius XE, beseitigen viele der Erschwernisse, wie ständige Nachfüllbestellungen oder die Verwaltung des Lagerstandes sowie die Verwaltung von Lieferungen, die Dewargefäße verursachen. Mit einem Generator müssen sich Labore auch keine Sorgen bezüglich von Unterbrechungen in der Lieferkette machen und können das Risiko umgehen kein Gas mehr zur Verfügung zu haben sowie die zusätzliche Unannehmlichkeit Gaszylindern oder Dewargefäße auszuwechseln, wenn diese leer sind. Des Weiteren bietet Ihnen ein Generator Vorteile, wie die Unabhängigkeit von ständig wechselnden und schwankenden Gaspreisen; sie vermindern Sicherheits- und Gesundheitsrisiken für Labormitarbeiter, die sonst schwere Gaszylinder umherbewegen müssen, ganz zu schweigen von der Gefahr große Mengen an Flüssigstickstoff im Labor zu lagern, die das Potenzial haben die atmosphärische Zusammensetzung der Luft im Labor zu verändern, was wiederum ein Risiko für Laborpersonal im Falle einer mangelhaften oder ausfallenden Belüftung darstellen würde (4).

Genius-XE-Generatoren wurden so entworfen, dass sie marktführend bezüglich der Stickstoffreinheit für LC-MS sind, um zu gewährleisten, dass Labore ihren kompletten Fokus auf ihre Analyse legen können mit dem sicheren Wissen, dass die Reinheit des vom Generator bereitgestellten Gases die bestmöglichen Ergebnisse liefert.

Für die Gewährleistung der Reinheit des Gases sind die Genius-XE-Generatoren mit einer Stickstoffmembran ausgestattet, die das Gas aus Druckluft aufbereitet. Bei der Aufbereitung des Gases durch die Membran wird ein Hohlfaser-Polymerbündel verwendet, das Sauerstoff von einströmender Druckluft trennt, wobei die Membran kleine O₂-Moleküle durch die Seitenwände der Faser lässt, während große N₂-Moleküle in der Membran aufgehalten und in einem Sammelbehälter gespeichert werden. Diese Methode der Stickstoffaufbereitung erzeugt bis zu 99,5% reines Gas bei für LC-MS-Applikationen erforderlichen Flussraten (normalerweise 15-70LPM, was aber von dem Gerät abhängig ist).

Was sind NMHCs und wieso könnten sie möglicherweise ein Problem darstellen?

Da der Reinigungsprozess von Stickstoff von der Raumluft abhängig ist, die innerhalb des Generators von einem ölfreien Kompressor zusammengepresst wird, können Immissionen ein Risiko für die Reinheit des Gases insgesamt darstellen, da die Membrantechnologie keine Unreinheiten innerhalb der Sauerstoffmoleküle aufgrund ihrer Größe herausfiltert. Deshalb können in manchen Laboren bzw. in Laboren ohne passende Filtrierungssysteme zusätzliche Verbindungen aus der Luft in das Massenspektrometer gelangen, was Einfluss auf die Empfindlichkeit des Geräts sowie auf die Wartungsintervalle hat.

Abhängig von der Jahreszeit sowie von der geographischen Beschaffenheit lassen sich mehrere kleinere Kohlenwasserstoffketten, wie u.a. Ethan, Propan, Butan und Pentan, die auch als Nichtmethan-Kohlenwasserstoffe (NMHC) bezeichnet werden, in einem Konzentrationsbereich von Teilchen pro Milliarde (ppb) bis hin zu Teilchen pro Millon (ppm) in der Atmosphäre finden. NMHCs sind dafür bekannt eine wichtige Rolle in der atmosphärischen Chemie zu spielen und ein Problem für Forscher im Labor darzustellen, da sie, abhängig von der Art der Analyse, Störungen in Bezug auf das Analyseergebnis verursachen können.

Die Entwicklung einer innovativen Lösung

In Anerkennung der Herausforderungen, die das Laborumfeld mit sich bringt und die Wichtigkeit, dass negative Einflüsse, die sich auf die Gasqualität und somit auf das Ergebnis auswirken, vermindert werden, wurden neue proprietären Kohlenwasserstoff-Filterungstechnologien für Genius XE entworfen, um Laboren einen höheren Grad an Schutz vor potenziellen Kontaminationen ihres Umfeldes zu bieten. Manche Labore nutzen In-Line Traps, um den Effekt von NMHC auf die Analyse zu verringern, aber die meisten Varianten, die der Markt zu bieten hat, besitzen nur eine geringe Kapazität und stellen keine langfristige Lösung für die Herausforderungen innerhalb des Laborumfelds dar, was als Resultat ständige Filterwechsel und einen Anstieg der Betriebskosten hervorbringt.

Die resultierende Filtration wurde entwickelt, um eine höhere Stickstoffreinheit durch das Eleminieren von NMHC aus der Raumluft zu gewährleisten. Die im Vereinigten Königreich am National Physical Laboratory durchgeführten Tests zeigten, dass Genius XE NMHC-Level auf bis zu unter 1ppm herabsetzen kann. Die zusammen mit Genius XE vorgestellte fortschrittliche NMHC-Filtrationsstufe erlaubt Ihnen Ihren Ergebnissen mehr Vertrauen zu schenken – vor allem, wenn Sie hochsensible Analysen durchführen oder eine übermäßige Menge an NMHC vorliegt, die für Interferenzen mit Zielanalyten sorgen könnten.

Die Verfahrensweisen

PEAK Scientific führte einen Vergleich zwischen dem Genius XE und einem Generator, der mit keiner Technologie für die Kohlenwasserstofffiltrierung ausgestattet war, durch, um das Signal-Rausch-Verhältnis während der Überprüfung eines Agilent-6495-Triple-Quad-Massenspektrometer in einem herausforderndem Umfeld zu testen.

Es wurden fünf Proben mit jeweils zwei Standards getestet: Chloramphenicol und Reserpin. Das 6495-Triple-Quad-Massenspektrometer wurde für die Testung von S/N auf Reserpin im Ionen-positiv-Modus bedient und im Ionen-negativ-Modus für Untersuchung von S/N auf Chloramphenicol.

Die Ergebnisse

Die Ergebnisse zeigten einen großen Leistungsunterschied zwischen den beiden Generatoren, während sie im Ionen-positiv-Modus in Betrieb waren. Der S/N-Anteil des PEAK-Chloramphenicol, nachdem die LC-MS im Ionen-negativ-Modus eingeschaltet war, zeigte, dass ohne HC-Filtrierungstechnologie ein dramatischer Abfall des S/N-Niveaus in manchen Laborumgebungen beobachtet werden konnte. Ein Durchschnitt von fünf Proben wies nach, dass ohne die Filtrierung von Kohlenwasserstoff der S/N-Anteil ungefähr bei 2200:1 lag im Vergleich zu einem Verhältnis 93,000:1, wenn der Stoff durch einen Filter lief.

Bei der Testung eines Reserpin-Standards im Ionen-positiv-Modus wurde erneut ein großer Unterschied bezüglich des S/N-Niveaus festgestellt, bei der die Kohlenwasserstofffiltrierungstechnologie im Genius XE ein S/N-Verhältnis von 113,431:1 für fünf Reserpineinspeisungen erreichte. Im Vergleich dazu brachte ein Generator ohne Filtrierungstechnologie nur einen Wert von 36,526:1 hervor.

getesteter Standard	Chloramphenicol (-ve Methode)		Reserpin (+ve Methode)
Gasquelle	Generator ohne HC-Filtrierung	Genius XE 70	Generator ohne HC-Filtrierung	Genius XE 70
Replikat 1 S/N	2178	99927	49139	118262
Replikat 2 S/N	2039	76943	26706	134984
Replikat 3 S/N	1532	126961	25523	115225
Replikat 4 S/N	2566	80180	37926	110140
Replikat 5 S/N	2578	83001	43334	88546
S/N-Durschnitt	2179	93402	36526	113431

Diskussion

Obwohl Laborinfrastrukturen und -prozesse ständig verbessert werden, befinden sich die Einflüsse von Umwelt und Veränderungen von Unreinheiten in der Luft außerhalb der Kontrolle von vielen Laborbelüftungssystemen. Jahreszeitliche Schwankungen, die veränderte Temperaturen und Niederschläge mit sich bringen, können den Grad von Schadstoffen in der Luft verändern, vor allem in großen Städten, was die Luftqualität in Laboren beeinflussen bzw. negativ verändern kann und meist unbemerkt bleibt. Gasgeneratoren sind eine von vielen Komponenten, die direkt oder indirekt mit der Probe oder dem Detektor während der Vorbereitung der Probe und der Analyse interagieren und können einen Einfluss auf Ergebnisse nehmen. Andere Komponenten, die möglicherweise eine Matrix in eine Probe einführen könnten, sind Lösungsmittel, welche aber mit Bedacht gewählt werden müssen, um eine Beeinflussung des Ionisierungszustands oder der für die Gasversorgung zuständigen Rohrleitungen zu vermeiden. Wenn minderwertige Kunststoffschläuche verwendet werden, die große Mengen an Weichmacher ausgasen, kann es in Bezug auf die Verschleierung von Zielanalyten zu Matrixeffekten kommen, was die Leistung des Geräts unmittelbar beeinflussen kann als Folge in der Ausgasung von flüchtigen Stoffen enden, was wiederum in der Unterdrückung von Ionen resultiert. Bei der Verwendung von Verrohrungen aus Metall, Edelstahl oder laborgradigem Kupfer sollte auf die Abdichtung von Fugen mit Epoxidharzen verzichtet werden.

Die Erkenntnis, dass jeder Teil des Prozesses für das Erzielen von optimalen Ergebnissen wichtig ist, bedeutet, dass durch die Verbesserung von analytischen Geräten auch die Peripherie, wie u.a. Gasgeneratoren, mithalten müssen. Dieser Denkansatz war die treibende Kraft hinter PEAKs neuer Produktentwicklung sowie der neusten mit Genius XE vorgestellten Technologie. Die Ergebnisse dieser Analyse zeigen wie wichtig die in Genius XE Stickstoffgeneratoren eingebaute Kohlenwasserstoffentfernungstechnologie bezüglich der Reduzierung von Ionensuppression ist und beweisen, wie die LC-MS-Leistung durch den Einsatz dieses hochmodernen Stickstoffgenerators verbessert werden kann.